Western Blot là gì?Western Blot tuyệt Immunoblot là nghệ thuật sử dụng các kháng thể sệt hiệt để phát hiện những protein chăm biệt được bóc chiết từ mô hoặc tế bào, đương nhiên mẫu cũng hoàn toàn có thể là vi khuẩn hoặc môi trường.

 

Nguyên lý hoạt động của Western BlotWestern Blot áp dụng kỹ thuật điện di để phân tách các protein dựa trên kích cỡ (SDS-PAGE 1 chiều) hoặc dựa trên cả form size lẫn năng lượng điện (SDS-PAGE 2 chiều), tiếp nối protein sẽ tiến hành chuyển lên màng lai nhằm gắn những kháng thể đặc hiệu. Trên kháng thể quánh hiệu gồm gắn phân tử phạt tín hiệu, dựa vào đó rất có thể phát hiện tại sự hiện diện của protein phương châm trên màng lai.




Bạn đang xem: Western blot là gì

*
Hình 1. Điện di proein trên gel poly-acrylamide (SDS-PAGE 1 chiều)

 

Quy trình tiến hành Western BlotTùy vào loại nguyên vật liệu đầu vào và đặc điểm của protein mục tiêu, những quy trình Western Blot rất có thể khác nhau ở một vài bước. Tuy nhiên, có thể sơ lược các bước Western Blot như sau:1) giải pháp xử lý mẫu bởi cơ học tập hoặc enzyme để bóc chiết protein mục tiêu2) Điện di đứng mẫu mã đã cách xử trí trên gel polyacrylamide nhằm mục đích phân bóc các protein trong mẫu3) chuyển protein đang phân tách (blotting) lên màng lai, thường xuyên là màng nitrocellulose hoặc PVDF4) Khóa màng (blocking) bởi albumin ngày tiết thanh bò (BSA) hoặc sữa không béo (non-fat milk) để ngăn chặn link không sệt hiệu của phòng thể lên màng (gây nhiễu tín hiệu)5) bình chọn protein bằng kháng thể, thông thường sẽ thực hiện 02 loại kháng thể: - chống thể sơ cấp (Ab1): kháng thể dính đặc hiệu lên protein phương châm - chống thể thứ cung cấp (Ab2): kháng thể bám đặc hiệu lên Ab1, bên trên Ab2 có gắn phân tử biểu thị dạng tạo nên màu, vạc quang chất hóa học hoặc phân phát huỳnh quang




Xem thêm: Nghĩa Của Từ Chi Phí Dự Phòng Tiếng Anh Là Gì ? Từ Điển Việt Anh Chi Phí Dự Phòng

*
Hình 2. Gửi protein lên màng (blotting), khóa màng và phát hiện tại protein mục tiêu

 

Một số lưu ý khi thực hiện Western Blot1) giải pháp xử lý mẫu: - Lysis Buffer có thể sẽ khác biệt tùy vào địa chỉ của protein mục tiêu (protein màng, nội bào, nhân, ty thể, …). Một số trong những trường hợp cần được sử dụng Lysis Buffer không cất SDS. - quá trình xử lý mẫu mã nên tiến hành ở ánh sáng thấp (khoảng 4°C) cùng cần bổ sung cập nhật các chất ức chế protease, phosphatase để bảo đảm an toàn protein sau khoản thời gian ly giải tế bào. - rất có thể định lượng protein bằng 01 vào các phương thức Bradford, Lowry, BCA hoặc đo OD 280nm. Mặc dù không nên thực hiện đo OD nếu rất cần được định lượng bao gồm xác.2) Điện di chủng loại trên gel: - hội chứng dương (Possitive Control): hội chứng dương là protein mục tiêu, được năng lượng điện di và chuyển lên màng giống hệt như mẫu thí điểm để bảo vệ Western Blot không chạm mặt sự cố, cũng như cho thấy thêm kháng thể vẫn sử dụng có thể bám quánh hiệu lên protein mục tiêu.  - Thang protein: cần có thang protein để khẳng định kích thước protein. Sát bên đó, thang protein cũng giúp theo dõi quy trình điện di và quá trình chuyển protein lên màng. - đề xuất chuyển protein lên màng ngay sau thời điểm hoàn tất quy trình điện di, bởi vì protein nhằm lâu đã thoát thoát ra khỏi tấm gel điện di.3) gửi protein lên màng với nhuộm: - ko được áp dụng thuốc nhuộm Coomassie vì sau khi nhuộm Coomassie sẽ không thể đưa protein lên màng lai được, gắng vào đó nên thực hiện thuốc nhuộm Copper. - việc chuyển protein lên màng hoàn toàn có thể thực hiện tại trong đk ướt (wet) hoặc buôn bán khô (semi-dry). đưa màng semi-dry sẽ nhanh hơn, còn gửi màng wet ít chạm mặt sự vậy hơn với được khuyến khích sử dụng với protein có size lớn (> 100 kDa). - đề xuất loại muối khỏi gel điện di trước lúc chuyển màng để tăng công dụng chuyển màng, muối bột tồn dư hoàn toàn có thể làm tăng mức độ dẫn điện cùng dẫn mang lại quá sức nóng - Khóa màng (blocking) hoàn toàn có thể sử dụng sữa không phệ hoặc BSA, tuy nhiên casein trong sữa là phospho-protein yêu cầu không được khuyến khích cho nghiên cứu và phân tích phospho-protein.

 

Sản phẩm đến Western Blot vị leveehandbook.net cung cấp 

1) khối hệ thống Western Blot - ChemiLITE ECL Western Blotting Package

*

 

2) Hệ thống Western Blot - ChemiPRO ECL Western Blotting Package

*

Hệ thống hiện bao gồm 4 package nhằm lựa chọn:

Package để chọn lựaBồn điện diRGB module
WESTERNFLOWPROMINIMini 
WESTERNFLOWPROMINIRGBMiniĐi kèm
WESTERNFLOWPROMAXIMaxi 
WESTERNFLOWPROMAXIRGBMaxiĐi kèm